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呋喃唑酮代謝物快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物呋喃唑酮代謝物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃唑酮代謝物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物呋喃唑酮代謝物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物呋喃唑酮代謝物的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：   0.01ppb

u 孵育溫度：       25℃

u 孵育時間：       30min~15min

u 樣本檢測下限

肌肉組織   ·································   0.05ppb

雞蛋    ·······································  0.05ppb

蜂蜜   ·········································  0.05ppb 

u 交叉反應(yīng)率

呋喃唑酮代謝物 ·································  100%

呋喃它酮代謝物 ·······························  ＜0.1%

呋喃妥因代謝物 ·······························  ＜0.1%

呋喃西林代謝物 ·······························  ＜0.1%

u 樣本回收率

肌肉組織   ·································  95%±25%

雞蛋    ······································  95%±25%

蜂蜜   ·······································  85%±23%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋

微量移液器：單道 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl

試      劑：*、K₂HPO₄·3H₂O、正己烷、乙酸乙酯、濃HCl

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

u 樣本前處理需配制

配液1  0.1M K₂HPO₄溶液：

稱11.4g K₂HPO₄·3H₂O加去離子水溶解定溶至500ml。

配液2  1M HCl 溶液：

取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml。

配液3  1M NaOH溶液：

稱4g NaOH加去離子水定容至100ml

配液4  樣本復(fù)溶液：

將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。

u 樣本處理

（a）肌肉、雞蛋樣本處理方法

稱取1±0.05g的均質(zhì)物，分別加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑，充分振蕩2min；

在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h)；

分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯，充分振蕩30s；

在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復(fù)離心；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）；

取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50℃氮氣/空氣吹干。

用2ml正己烷溶解干燥物，再加入1ml樣本復(fù)溶液充分混合30s；在室溫下4000r/min以上離心10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，重復(fù)離心）；

取50µl下層用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  2倍

（b）蜂蜜樣本處理方法

稱取2±0.05g的均質(zhì)物（蜂蜜），分別加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑，充分振蕩2min；

在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h)；

分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯，充分振蕩30s；

在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復(fù)離心；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）；

取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50℃氮氣/空氣吹干；

用2ml正己烷溶解干燥物，再加入1ml樣本復(fù)溶液充分混合30s；在室溫下4000r/min以上離心10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，重復(fù)離心）；

取50µl下層用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

u 測定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物50µl/孔，然后再加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

6、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃唑酮代謝物量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.01ppb為1.816；0.03ppb為1.415；0.09ppb為0.74；0.27ppb為0.313；0.81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.27ppb～0.81ppb；樣本2的濃度范圍是0.03ppb～0.09ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

八、 注意事項

1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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