波多野结衣 黑人丨亚洲va国产日韩欧美精品色婷婷丨国产爽爽久久影院潘金莲丨国产玉足脚交欧美一区二区丨欧美一区二区在线丨日本免费一区二区三区激情视频丨欧美大片免费观看在线观看网站推荐丨一个本道久久综合久久88丨国产精品美女久久久久久2021丨亚洲中文欧美在线视频丨国产亚洲精品麻豆一区二区丨精品xxxxx丨人妻夜夜爽天天爽一区二区丨在线爽丨97在线成人国产在线视频丨久久22丨久久91丨农村少妇野战做爰全过程丨日韩久久免费丨秋霞无码久久久精品丨久久艹中文字幕丨懂色av一区二区三区免费看丨日本人妻巨大乳挤奶水丨中文字幕日本精品一区二区三区丨国产三级在线观看播放

Ni瓊脂糖凝膠說明書

Ni-Agarose Resin for 6×His-Tagged Proteins 

目錄號：  K0010       

保    存：  20%乙醇中          2-8℃保存 

組分說明 

                     Cat.No.        K0010A         K0010C

                     Volume           10ml         100ml

產品簡介

      該鎳柱純化系統對6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有 6 個組氨酸親和標簽的蛋白。該系統具有4 個 Ni2+ 螯合位點，較只有3 個螯合位點的Ni-IDA 結合Ni2+更為牢固，有效防止純化過程中Ni2+脫落且增強對His 標簽蛋白的結合能力，提高純化效率。較高的基團密度，大大提高了蛋白載量。該系統在天然或變性條件下，對來源于各種表達系統（如桿狀病毒，哺乳細胞，酵母以及細菌）中的 His 標簽蛋白，均有很好的純化效果。本產品已螯合鎳離子，可直接使用，方便，快捷。

支持物：CL-6B 瓊脂糖凝膠

      載量：20-30mgHis標簽蛋白/ml 填料

      粒徑：50-160μm

注意事項 

 1. 緩沖液中不建議使用β-巰基乙醇、DTT 和EDTA。

 2. 整個純化過程中切忌凝膠脫水變干。

 3. 為提高純化效率，首先確定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的最-#佳使用濃度。可以使用線性或梯度濃度的咪唑（20-500mM）洗脫蛋白，并通過SDS-PAGE 或 WesternBlotting 來檢測目的蛋白的純度。

 4. 請使用高純度的試劑配制緩沖液，并通過0.45µm 過濾器過濾。為避免柱子被堵塞，建議將裂解液進行離心，或者使用 0.45µm 過濾器過濾。

 5. 柱再生時，保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。

操作步驟 

組裝層析柱 

 1. 將填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10 分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。

 注意：（1）填料的上層是乙醇保護層，將填料和乙醇一起混勻，以每ml填料純化20-30mgHis標簽蛋白計算，取需要的填料與乙醇的混合液加入層析柱。

（2）如果乙醇不流出，可以給柱子一個外力，例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。                                                        

（3）本實驗都是通過重力作用使溶液流出。

 2. 向裝填好的柱中加入5 倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用 10 倍柱體積的Binding Buffer  平衡柱子，平衡結束后即可上樣。

 注意：柱體積指的是填料的體積。

I  可溶性蛋白的純化（SolubleBindingBuffer和SolubleElutionBuffer配方詳見附表1） 

 1.  收集菌體后，每100mg菌體（濕重）加入1-5 ml細菌裂解液，超聲裂解菌體。

 2.  將菌體裂解液負載上柱，流速為10倍柱體積/小時。

 3.  使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子，收集流穿峰。

 4.  使用5倍柱體積的Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。

 5.  洗脫后，依次使用3倍柱體積的Soluble Binding Buffer和5倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），4℃保存。

II  包涵體蛋白的純化（InclusionBodyBindingBuffer和 InclusionBodyElutionBuffer配方詳見附表2） 

 1. 收集菌體后，每100mg菌體（濕重）加入1-5 ml  細菌裂解液，超聲裂解菌體。

 2. 離心，棄上清，將沉淀重懸于Soluble Binding Buffer中（如有需要，可進行超聲波處理，超聲前可加入1-5mM磷酸酶抑制劑混合物）。

 3. 重復操作2，直至包涵體清洗干凈（呈較潔凈的乳白色狀）。

 4. 將沉淀重懸于Inclusion BodyBinding Buffer中，冰浴1小時，使包涵體溶解。

 5. 10,000×g離心20分鐘，將上清以孔徑為0.45 μm的濾膜過濾。

 6. 將蛋白溶液負載上柱，流速為10倍柱體積/小時。

 7. 使用15倍柱體積的Inclusion BodyBinding Buffer沖洗柱子，收集流穿峰。

 8. 使用5倍柱體積的Inclusion Body Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。

 9. 洗脫后，依次使用3倍柱體積的Inclusion BodyBinding Buffer和5倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），4℃保存。

     注意：在純化包涵體蛋白時，所有緩沖液均含有變性劑，需要降低 BindingBuffer 中的咪唑濃度（5mM 或更低）。洗脫時，若蛋白在較高pH下洗脫失敗，可以選用低 pH 緩沖液作為洗脫緩沖液（pH6.5，pH5.9 或 pH4.5）。 柱再生 當填料使用多次后，結合效率會有所下降（表現為流速變慢或填料失去藍綠色），可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質的結合效率。

 1. 使用2 倍柱體積的6M  鹽酸胍沖洗后，使用3 倍柱體積的去離子水沖洗。

 2. 使用 1 倍柱體積2% SDS 沖洗。

 3. 依次使用 1 倍柱體積的25%、50%、75%和5 倍柱體積100%乙醇沖洗，再依次使用 1 倍柱體積的75%、50%、25%的乙醇沖洗。

 4. 使用 1 倍柱體積的去離子水沖洗。

 5. 使用 5 倍柱體積含50 mM EDTA 緩沖液（PH8.0）沖洗。

 6. 使用 3 倍柱體積去離子水，3 倍柱體積20%乙醇沖洗。

 7. 4°C 保存。

 8. 再次使用前，需首先使用10 倍柱體積去離子水沖洗，然后使用5 個柱體積的      50 mM NiSO4再生，3 個柱體積的Binding Buffer   平衡。

 1: 蛋白分子量標準  

（分子量由大到小分別為：90/66/45/27/  14.4kDa）

2: 全菌裂解液

 3: 流穿收集液

 4: 洗脫收集液    

1（洗脫緩沖液，含     500mM   咪唑，收集第1 個柱體積）

 5: 洗脫收集液

2（洗脫緩沖液，含 500mM 咪唑，收集第 2 個柱體積）

 6: 洗脫收集液

3（洗脫緩沖液，含500mM咪唑，收集第3 個柱體積）

7: 洗脫收集液

 4（洗脫緩沖液，含500mM 咪唑，收集第 4 個柱體積）

 附表 

 附表  1. 可溶性蛋白純化緩沖液配方

                                                         

成分                    Tris-HCl（PH7.9）   咪唑            NaCl

SolubleBindingBuffer              20mM      10mM       0.5M

SolubleElutionBuffer              20mM        500mM     0.5M



    

附表  2. 包涵體蛋白純化緩沖液配方

 成分                 Tris-HCl（PH7.9）    咪唑    NaCl     尿素/鹽酸胍

InclusionBodyBindingBuffer      20mM     5mM  0.5M    8M/6M

InclusionBodyElutionBuffer       20mM   500mM   0.5M    8M/6M

    

實驗代做服務：