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EF46A\K4                     2018-01版

黃曲霉毒素總量

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物黃曲霉毒素總量將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗黃曲霉毒素總量抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素總量的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素總量的含量。

二、試劑盒特性

1. 試劑盒靈敏度：   0.02ppb
2. 孵育溫度：       25℃
3. 孵育時間：       30min～15min
4. 樣本檢測下限

飼料 大米、玉米、花生、組織、食用油··········· 2 ppb

1. 交叉反應(yīng)率

黃曲霉毒素B1  ··································· 100%

黃曲霉毒素M1 ····································· 91.2%

黃曲霉毒素B2 ····································· 68.4%

黃曲霉毒素G1 ······································· 4.7%

黃曲霉毒素G2 ······································· 2.7%

1. 樣本回收

飼料 大米、玉米、花生、組織、食用油 ······· 95±35%

• 試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、打印機

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：甲醇、正己烷

五、樣本前處理步驟

1. 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

1. 樣本前處理需配制：

配液1  樣本復(fù)溶液： 

用去離子水將20×濃縮復(fù)溶液按1：19稀 

釋（1份20×濃縮復(fù)溶液+19份去離子水）。

配液2  樣本提取液： 

將甲醇與去離子水按7:3比例混合均勻（7份甲醇+3份去離子水）。

1. 樣本處理：     

（a）組織、飼料、大米、玉米樣本處理方法：

1. 取1.0±0.05g研碎的樣本于50ml離心管中；加入5ml樣本提取液，充分振蕩3min，20℃ 4000r/min以上離心10min；
2. 取上清100µl，加入700µl樣本復(fù)溶液，充分振蕩混勻；
3. 取50µl用于分析。

  樣本稀釋倍數(shù)：40倍  

（b）食用油樣本處理方法：

1. 取1.0±0.05g食用油樣本于50ml離心管中；加入5ml樣本提取液，再加入4ml正己烷，充分振蕩3min，20℃ 4000r/min以上離心10min；
2. 去掉上清，取中間層液體100µl，加入700µl樣本復(fù)溶液，充分振蕩混勻；
3. 取50µl用于分析。

  樣本稀釋倍數(shù)：40倍   

（c）花生樣本處理方法：

1.    取1.0±0.05g研碎的花生樣本于50ml離心管

     中；加入5ml樣本提取液，再加入4ml正己

     烷，充分振蕩3min，20℃ 4000r/min以上離

     心10min；

1.   去掉上清，取中間層液體100µl，加入400µl

    樣本復(fù)溶液，充分振蕩混勻；

3.   取50µl用于分析

    樣本稀釋倍數(shù)：25倍  

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

1. 測定前應(yīng)須知：

1. 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3. 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4. 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

1. 操作步驟：

1. 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。
3. 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4. 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
6. 將孔內(nèi)液體甩干，用稀釋后的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7. 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
8. 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含黃曲霉毒素總量量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.02pb為1.816；0.06ppb為1.415；0.18ppb為0.74；0.54ppb為0.313；1.62ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.54ppb～1.62ppb；樣本2的濃度范圍是0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素總量實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素總量實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、 注意事項

1. 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3. 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4. 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5. 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6. 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7. 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
8. 該試劑盒理想反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1. 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。
2. 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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